單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）技術的飛速發展使人們對組織中細胞種類、細胞的特殊狀態有了深入認識。 但是，scRNA-seq 對于器官或者固體組織制備的細胞懸液的細胞活性和細胞數目有著較高的要求，這也意味著“躺在”超低溫冰箱中的大量珍貴臨床樣本（腦組織，腫瘤組織等）都無法進行 scRNA 測序。 而單細胞核 RNA 測序技術（snRNA-seq）的出現，則在很大程度上解決了以上問題。

雖然細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)核(he)內(nei)的(de)(de)(de)(de)遺(yi)傳(chuan)物質可(ke)以大體代表整個細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，然而(er)，細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)質和(he)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)核(he)之間的(de)(de)(de)(de) RNA 類型(xing)和(he)比例卻存在一定的(de)(de)(de)(de)差異。RNA 首(shou)先在細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)核(he)內(nei)轉錄，并(bing)在細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)核(he)內(nei)積累到(dao)穩定狀態。在細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)質中(zhong)，mRNA 根據其出核(he)率(lv)(lv)和(he)不同(tong)的(de)(de)(de)(de)命運，包括(kuo)轉運到(dao)特定的(de)(de)(de)(de)亞細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)位置、核(he)糖體的(de)(de)(de)(de)翻譯(yi)、小 RNA 的(de)(de)(de)(de)降解等(deng)，達到(dao)不同(tong)的(de)(de)(de)(de)穩態水平。研(yan)(yan)究(jiu)人員發(fa)(fa)現，細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)核(he) RNA 中(zhong)含有(you)大量的(de)(de)(de)(de)非編碼序(xu)列，其中(zhong)包含 41% 的(de)(de)(de)(de)基因間區序(xu)列和(he) 25% 的(de)(de)(de)(de)內(nei)含子序(xu)列。同(tong)時，研(yan)(yan)究(jiu)人員也發(fa)(fa)現有(you) 41.7% 的(de)(de)(de)(de)轉錄本序(xu)列只(zhi)在細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)核(he)中(zhong)存在。多項研(yan)(yan)究(jiu)表明，將(jiang)內(nei)含子區域(yu)的(de)(de)(de)(de) reads 增加了 snRNA-seq 的(de)(de)(de)(de)敏感性，并(bing)提高識別(bie)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型(xing)的(de)(de)(de)(de)分辨(bian)率(lv)(lv)。因此，在處理單細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)核(he) RNA 測序(xu)數據時，納入內(nei)含子序(xu)列具有(you)重要意義。下面，就(jiu)讓我們詳細(xi)(xi)(xi)(xi)了解一下針對不同(tong)組織樣(yang)本進行 snRNA-seq 的(de)(de)(de)(de)部(bu)分案例與(yu)要點。

腦組織樣本的 snRNA-seq

對于腦組織來說，scRNA-seq 并不能全面地分析神經細胞的類型。一些細胞類型更容易受到組織解離過程的影響，比如在成人的新大腦皮層中，非神經元細胞在解離中比神經元耐受性更好，在單細胞懸浮液中大量存在；在小鼠新皮層中，第 5 層 parvalbuin 陽性的間神經元和皮質下突起的谷氨酸能神經元的比例低于預期。相反，細胞核對機械處理更有抵抗力，可以從冷凍組織中解離出來。 研究發現，單個細胞核已被證明可以提供足夠的基因表達信息來定義成人大腦和小鼠海馬區相對寬泛的細胞類別。 此外，新鮮解離的神經組織很難獲得；相比之下，從意外去世或者因疾病去世后病人處所獲得的正常和疾病組織，是研究大腦組織中細胞類型的主要樣本類型。 但是，這些組織通常是冰凍的樣本，因此 snRNA-seq 是解決細胞類型少以及冰凍樣本的重要方法。

研究發(fa)現(xian)，從冷(leng)凍的 S1 皮層中分離(li)單(dan)個核，進行(xing)神經核抗原(yuan)（NeuN) 流動分選，并(bing)在 Fluidigm C1 系統上進行(xing) RNA 測(ce)序，細(xi)(xi)胞(bao)核和(he)細(xi)(xi)胞(bao)數(shu)據(ju)顯(xian)示檢測(ce)到的基因數(shu)量和(he)類型相似（S1 細(xi)(xi)胞(bao)核 - 平均 5619 個基因；S1 細(xi)(xi)胞(bao) - 平均 4797 個基因）。核數(shu)核據(ju)含有(you)較高比例的內(nei)含子(zi) reads。

圖。SnRNA-seq 揭(jie)示了興奮性(xing)神經元的(de)特性(xing)

Grubman?等人通過對(dui)從去世后的(de)阿爾茨海默氏(shi)癥(zheng)患(huan)(huan)者和(he)年齡(ling)匹(pi)配的(de)非疾(ji)病(bing)患(huan)(huan)者身上(shang)提取的(de)內嗅(xiu)皮(pi)層組織進行 snRNA-seq，得(de)到了(le) 13,214 個細(xi)胞(bao)(bao)，每個細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)位數檢測到 646 個基因。UMAP 顯(xian)示，共鑒定(ding)到了(le)小(xiao)膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)、星形(xing)膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)、神經(jing)元(yuan)、少突(tu)膠(jiao)質(zhi)祖細(xi)胞(bao)(bao)（OPCs)，少突(tu)膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)和(he)內皮(pi)細(xi)胞(bao)(bao)。

圖。人內(nei)嗅皮層 snRNA-seq 揭示阿爾(er)茨海(hai)默(mo)病中細胞類(lei)型特異(yi)性標記基因和細胞類(lei)型特異(yi)性改變

同樣是阿(a)爾茲海默癥疾病(bing)，Mathys 等人通過對冷凍的(de)去世后病(bing)人腦組織進(jin)行 snRNA-seq，共鑒(jian)定到了人類(lei)大腦的(de)主要細胞(bao)(bao)類(lei)型：興奮性神經元(yuan)(yuan)（NRGN 標記），抑制性神經元(yuan)(yuan)（GAD1)，星形(xing)膠(jiao)質(zhi)細胞(bao)(bao)（AQP4)，少(shao)突膠(jiao)質(zhi)細胞(bao)(bao)（MBP)，小膠(jiao)質(zhi)細胞(bao)(bao)（CSF1R 和(he) CD74)、少(shao)突膠(jiao)質(zhi)祖(zu)細胞(bao)(bao)（VCAN)、內皮(pi)細胞(bao)(bao)和(he)周(zhou)細胞(bao)(bao)（AMBP)。

圖(tu)。snRNA-seq 譜(pu)分析阿(a)爾茲海默癥病人腦組(zu)織中(zhong)細胞(bao)類型

心臟組織樣本的 snRNA-seq

在心臟的單細胞 RNA 測序研究中也存在著許多難點。 首先，成年的心臟組織較難消化，很難保證在不損傷細胞的情況下，得到高質量的細胞懸液；再者，由于心肌細胞大，且形狀不規則，導致細胞捕獲較難。因此，心臟的研究通常依賴胚胎和新生兒的小鼠心臟或關注成年小鼠心臟的非心肌細胞群來避免這些問題。2020 年發表的一篇關于哺乳動物心臟單細胞核 RNA 測序探索細胞成分和細胞特征的文章，則在一定程度上掃除了心臟單細胞 RNA 測序的障礙。snRNA-seq 分(fen)析得到(dao)了 8635 個(ge)(ge)細(xi)胞(bao)核(he)和(he)(he) 22,568 個(ge)(ge)基(ji)因，每個(ge)(ge)細(xi)胞(bao)平均(jun)得到(dao) 2662.6 reads。UMAP 顯示了 24 個(ge)(ge)不同的細(xi)胞(bao)類(lei)群，其中較多的是內皮細(xi)胞(bao)（28.8%)、成纖維細(xi)胞(bao)（25.3%) 和(he)(he)心肌細(xi)胞(bao)（22.8%)，它(ta)們(men)分(fen)別含有約 2500 個(ge)(ge)、2200 個(ge)(ge)和(he)(he) 2000 個(ge)(ge)細(xi)胞(bao)核(he)。

圖。snRNA-seq 譜分析心臟組織中細(xi)胞類型

Cui 等人使用(yong) snRNA-seq 揭示再(zai)生(sheng)(sheng)新(xin)生(sheng)(sheng)兒(er)和非再(zai)生(sheng)(sheng)晚期心(xin)(xin)臟心(xin)(xin)肌細胞的(de)不同(tong)群體。結果表明，一個明顯的(de)未(wei)成熟的(de)心(xin)(xin)肌細胞群體進入(ru)細胞周(zhou)期響(xiang)應(ying)損傷。對這(zhe)些心(xin)(xin)肌細胞的(de)轉錄組分析揭示了支持新(xin)生(sheng)(sheng)兒(er)再(zai)生(sheng)(sheng)反(fan)應(ying)的(de)基(ji)因調控網絡，該網絡的(de)缺失與再(zai)生(sheng)(sheng)阻斷相(xiang)一致。

圖。snRNA-seq ; 確定新生兒心(xin)臟中不同(tong)的(de)心(xin)肌細胞(bao)群

腎臟組織樣本的 snRNA-seq

2019 年，來自華盛頓大學醫學院的 Benjamin D. Humphreys 團隊比較分析了 腎臟組織的單細胞 RNA 測序（scRNA-seq) 和腎臟組織的單細胞核 RNA 測序（snRNA-seq) 在腎臟細胞類群鑒定中的區別。 與 scRNA-seq 相(xiang)比，snRNA-seq 捕(bu)獲了多種在 scRNA-seq 數(shu)據(ju)集中不(bu)存(cun)在的腎(shen)臟細(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型，包(bao)括(kuo)腎(shen)小球足細(xi)胞(bao)(bao)、系膜細(xi)胞(bao)(bao)和(he)內皮(pi)細(xi)胞(bao)(bao)。同時也未檢(jian)測到應激反應基因。與已發表的 scRNA-seq 數(shu)據(ju)集（分別為 2.4% 和(he) 0.12%) 相(xiang)比，snRNA-seq 方法產生了 20 倍以(yi)上的足細(xi)胞(bao)(bao)。

圖。加上內含子 reads，snRNA 測(ce)序的表(biao)現相當于(yu)(yu)或優于(yu)(yu) scRNA 測(ce)序 

Wilson 等人(ren)通過對冷凍保(bao)存的糖尿病(bing)人(ren)腎臟樣本進行 snRNA-seq，共得到 23,980 單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)核數據，其中(zhong)包括(kuo) 11 種腎臟細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類型和 4 種免疫細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類型（近曲小管(guan)(guan)；CFH，補體因子(zi) H 陽性(xing)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)；亨(heng)利循環(huan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)；遠曲小管(guan)(guan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)；連接(jie)小管(guan)(guan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)；集尿管(guan)(guan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)；主細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)；插入細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)；阿足突細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)；內皮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)；系膜(mo)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)；白細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)）。

圖。snRNA 測序鑒定腎臟細胞及免(mian)疫細胞種(zhong)類

結   語

總結而言，單細胞(bao)(bao)(bao)核(he)(he)測序技(ji)術(shu)在樣本(ben)適用性上(shang)較單細胞(bao)(bao)(bao) RNA 測序技(ji)術(shu)更有優勢，它不局限于(yu)新鮮的(de)組織樣本(ben)，適用于(yu)冰凍樣本(ben)。此外(wai)，單細胞(bao)(bao)(bao)核(he)(he)的(de)制備(bei)(bei)相(xiang)對于(yu)單細胞(bao)(bao)(bao)懸液(ye)的(de)制備(bei)(bei)要更簡單，可以盡量減少酶解，機械壓(ya)力誘導(dao)的(de)假的(de)細胞(bao)(bao)(bao)類群的(de)產生。在數據(ju)分析方面(mian)，單細胞(bao)(bao)(bao)核(he)(he) RNA 測序可以獲得內含(han)子區、基因(yin)間(jian)區的(de)數據(ju)，使細胞(bao)(bao)(bao)類型的(de)鑒定分辨率更高，獲得的(de)基因(yin)信(xin)息相(xiang)對更加豐富。

但是單細胞核測序可以取代單細胞 RNA 測序么？ 答(da)案一定是 NO!  在選(xuan)擇兩種(zhong)方(fang)法(fa)時，要更(geng)多的(de)(de)(de)(de)結合(he)(he)自身的(de)(de)(de)(de)條件來(lai)(lai)確定。自己(ji)有什么樣(yang)本？是否可以制備合(he)(he)格的(de)(de)(de)(de)細胞懸液？是否有對酶敏感的(de)(de)(de)(de)細胞類型？各項因(yin)素都需(xu)要綜合(he)(he)考慮。未來(lai)(lai)，單細胞核(he) RNA 測序(xu)與(yu)單細胞 RNA 測序(xu)的(de)(de)(de)(de)結合(he)(he)可能是全面獲得(de)樣(yang)本中細胞類型的(de)(de)(de)(de)策略。也讓我(wo)們期待廣大的(de)(de)(de)(de)科研工作者來(lai)(lai)解密。

伯豪生物單細胞多組學研究一站式服務優勢

平臺齊全

擁有 BD、10X Genomics、SMART-seq 三大(da)單(dan)細胞測序服(fu)務平臺。

經驗豐富

累計制(zhi)備 50 余(yu)種組織類型的單(dan)細胞樣本(ben)，細胞活率平均 90% 以(yi)上。

樣本制備

單(dan)(dan)細胞(bao)測序(xu)樣本保存(cun)液、單(dan)(dan)細胞(bao)核分離試劑盒以及(ji)單(dan)(dan)細胞(bao)懸(xuan)液制(zhi)備方法完(wan)美(mei)解決單(dan)(dan)細胞(bao)樣本制(zhi)備問題(ti)。

數據分析

建立了完善的單細胞測序（核）數據(ju)處(chu)理方法及個性化分析方法和流(liu)程。

參考文獻

1. Wilson P C, Wu H, Kirita Y, et al. The single-cell transcriptomic landscape of early human diabetic nephropathy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2019, 116(39): 19619-19625.

2. Lake B B, Ai R, Kaeser G E, et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain[J]. Science, 2016, 352(6293): 1586-1590.

3. Bakken T E, Hodge R D, Miller J A, et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types[J]. PLOS ONE, 2018, 13(12).

4. Selewa A, Dohn R, Eckart H, et al. Systematic Comparison of High-throughput Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation.[J]. Scientific Reports, 2020, 10(1).

5. Lake B B, Codeluppi S, Yung Y C, et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 6031-6031.

6. Barthelson R, Lambert G M, Vanier C H, et al. Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells[J]. BMC Genomics, 2007, 8(1): 340-340.

7. Zhang Y, Gagolopez N, Li N, et al. Single-cell imaging and transcriptomic analyses of endogenous cardiomyocyte dedifferentiation and cycling.[J]. Cell discovery, 2019, 5(1).

8. MiaoCui,ZhaoningWang,KenianChen,AkanshaM.et ;al. Dynamic Transcriptional Responses to Injury of Regenerative and Non-regenerative Cardiomyocytes Revealed by Single-Nucleus RNA Sequencing[J]. Dev Cell . 2020 Apr 6;53(1):102-116.e8.  

9. Grubman A, Chew G, Ouyang J F, et al. A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer’s disease reveals cell-type-specific gene expression regulation[J]. Nature Neuroscience, 2019, 22(12): 2087-2097.

10. Wolfien M, Galow A, Muller P, et ;al. Single-Nucleus Sequencing of an Entire Mammalian Heart: Cell Type Composition and Velocity[J]. Cells, 2020, 9(2).

11. Mathys H, Davilavelderrain J, Peng Z, et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer’s disease[J]. Nature, 2019, 570(7761): 332-337.

12. Wu H, Kirita Y, Donnelly E L, et al. Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis[J]. Journal of The American Society of Nephrology, 2019, 30(1): 23-32.